七种药物对微小牛蜱的半数致死浓度测定

用浸渍法测定了楝素、三氟氯氰菊酯、苦皮藤、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、哒嗪酮、螨净 7种药物对未吸血的微小牛蜱 (Boophilusmicroplus)幼蜱、若蜱、成蜱及其饱血雌蜱的半数致死浓度(LC50 )。结果显示 ,所用药物中半数致死浓度最低的 3种药物是楝素、三氟氯氰菊酯、苦皮藤。植物性杀虫剂楝素对未吸血微小牛蜱的幼蜱、若蜱、成蜱及饱血雌蜱的半数致死浓度分别为3.0 1～ 3.13、4 .37～ 4 .77、11.18～ 11.36、2 75 .5 0～ 2 76 .5 0mg/L ;植物性杀虫剂苦皮藤对未吸血微小牛蜱的幼蜱、若蜱、成蜱及饱血雌蜱的半数致死浓度分别为 4 .2 2～ 4 .4 2、10 .30～ 10 .5 0、82 .5 0～82 .70、6 35 .30～ 6 36 .70mg/L ;人工合成的除虫菊酯类的三氟氯氰菊酯对未吸血微小牛蜱的幼蜱、若蜱、成蜱及饱血雌蜱的半数致死浓度分别为 3.4 2～ 3.4 4、7.10～ 9.0 6、4 2 .30～ 4 2 .5 0、5 45 .5 0～5 46 .70mg/L。     

微小牛蜱幼蜱cDNA表达文库的构建

为了研究微小牛蜱功能性抗原基因,从微小牛蜱(Boophilus microplus)幼蜱中提取总RNA并分离纯化mRNA。采用Oligo(dT)引物合成双链cDNA,在其两端加EcoRⅠ、HindⅢ定向接头,用Mini Column Fractionation凝胶过滤柱纯化后定向克隆到λSCREEN载体。经体外包装,成功构建了我国微小牛蜱幼蜱cDNA表达文库,铺板测定原始库容量为4.5×105PFU,扩增后的滴度为7.2×1010PFU/mL。     

微小牛蜱Bm86基因的克隆及真核表达载体的构建

为了克隆微小牛蜱Bm86 基因及构建该基因的表达载体,以微小牛蜱饥饿幼蜱的破解物提取的总RNA为模板,参照已发表的微小牛蜱Bm86基因的核苷酸序列,设计了1对引物,采用RT-PCR技术获得微小牛蜱Bm86基因;将Bm86基因克隆入载体,并进行序列分析,结果证明,克隆的Bm86基因序列与GenBank上登录的Bm86基因序列的同源性达97.4%,而且该序列包含完整的开放阅读框。将该基因克隆入真核表达载体 pPIC9K,构建并获得了重组真核表达载体pPIC9K-Bm86。     

微小牛蜱Bm86基因的真核表达

采用RT-PCR技术从微小牛蜱饥饿幼蜱破解物中扩增到Bm86基因,将其与巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K重组构建了重组表达载体pPIC9K-Bm86,测序正确后将其用SacⅠ内切酶线性化后采用电穿孔法转化巴斯德毕赤酵母菌GS115,经G418抗性筛选高拷贝重组菌株后用甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western-blotting分析结果表明,诱导表达的培养上清液中表达出具有反应活性的68 ku重组Bm86蛋白,目的蛋白约占培养上清液中蛋白总量的32%以上,诱导96 h目的蛋白的表达量为0.36 mg/mL。     

微小牛蜱雌蜱唾液腺消减cDNA文库的构建与分析

以我国微小牛蜱半饱血雌性成蜱唾液腺cDNA为检测子Tester),饥饿雌性成蜱cDNA为驱动子(Driver),采用抑制消减杂交技术和T/A克隆技术构建了微小牛蜱半饱血雌性成蜱唾液腺消减cDNA文库。对获得的158个阳性克隆进行PCR鉴定,显示插入片段主要集中在200~550bp之间,挑取60个阳性克隆进行测序,共获得了14个有效ESTs,生物信息学分析推测,它们所编码的功能性蛋白包括卵黄蛋白原、基质蛋白、富含脯氨酸蛋白质、OTM-3假定蛋白等。根据基因序列设计引物,以微小牛蜱DNA为模板,对所得ESTs进行鉴定,证明它们都是微小牛蜱所固有的。该项工作为进一步研究微小牛蜱唾液腺差异表达基因奠定了基础。